蛋白质组学技术专家
定性蛋白组
蛋白质全谱鉴定

蛋白质全谱分析也可称为质谱shotgun分析,指的是组分分析,研究对象是完整的组织、体液或其提取物,其目的在于鉴定出尽可能多的肽和蛋白质分子。其原理为将溶液内蛋白质分子或SDS-PAGE条带的复杂混合物酶解成肽段混合物,通过液相色谱分离,如2D-LC(阳离子柱SCX和C18反相柱串联)或1D-LC的C18反相柱。串联质谱测试,最后用相应的数据库进行检索匹配,可同时鉴定成百上千种蛋白质。基于质谱技术的全谱分析,可为蛋白高通量的定量和修饰分析提供参考信息。此外,将全谱分析数据和转录组数据结合,可相互补充并共同验证基因注释。

传统的方法如蛋白质微量测序、氨基酸组成分析(如Edman降解法)费时费力、通量低,存在不容易实现规模化和自动化,结果灵敏度差等问题。当前主流的基于软电离技术的液相色谱-质谱系统(LC-MS/MS)是实现高通量蛋白鉴定的主要方法。

其基本原理是:首先将纯化后的蛋白质用消化酶(如胰酶)水解成肽段,肽段混合物经过除盐后首先进入液相色谱,实现初步分离,以降低样品复杂度。经液相色谱分离后的肽段先经过质谱的第一级--离子源(ESIMALDI)使肽段离子化并形成分散的离子。接着选择部分强度较高的肽段母离子进入质谱的第二级系统(碎裂源)做进一步碎裂,使肽段离子被打碎成更小的、有规律的碎片离子。理论上蛋白质序列经过酶解后形成肽段,肽段再经过理论二级碎裂形成理论的二级碎片离子谱图。然后用实验产生的MS/MS谱图信息(主要包括质荷比、离子强度)与理论产生的MS/MS谱图信息比对,通过比较两者的相似度来确定谱图对应哪个肽段/蛋白。其中理论蛋白质数据库来自基因组预测或前期实验验证等数据。

目前,常用的数据库有NCBI-nrUniprot等。常用的搜索引擎有MascotProteinpilotMascot一度被业界奉为鉴定软件的金标准,但其算法更偏向于鉴定长度较短的肽段序列。而Proteinpilot由于采用自动容错匹配、对所有可能的蛋白修饰采用了盲搜的策略,无肽段长度偏向性,鉴定效果更好。


应用领域
  • 蛋白质表达谱和混合蛋白质的鉴定

  • 相互作用蛋白鉴定

  • 物种组织、细胞或者细胞器中所有表达蛋白质的鉴定

  • 要求物种具有蛋白质参考数据库、EST序列(转录组)或基因组注释信息

技术优点
  • 通量大:一次实验可鉴定6000多种蛋白质(以人HepG2为例)

    • 结果准确可靠:质谱仪的质量精度可达到1ppm以下,分辨率能达到4x104以上,可提供高质量的数据
    • 适用范围广泛:对物种要求无限制,理论上适用于任何物种。


样品要求
样品类别样品要求其他
双向凝胶电泳胶点考染、银染点清晰可见

银染过程中未使用戊二醛作为固定剂

用去离子水防干,干冰或冰袋寄送

SDS-PAGE胶条

考染、银染点条带清晰可见


银染过程中未使用戊二醛作为固定剂

用去离子水防干,干冰或冰袋寄送

蛋白质溶液

蛋白质总量>5μg,浓度>0.1μg/μl

缓冲液不含去污剂NP40、Trioton X-100等

挥发性盐<20mM,无PBS、SDS和尿素等物质

干冰或冰袋寄送

蛋白质干粉

蛋白质总量>5μg,浓度>0.1μg/μl

干冰或冰袋寄送
细胞样品细胞数目>1x10^6/样品干冰或冰袋寄送
组织样品样品总量>200mg/样品干冰或冰袋寄送
体液样品血清>200μl、尿液>1ml、泪液>1ml干冰或冰袋寄送

*需详细填写样品来源、含量、状态和其他信息

最终交付
  • 鉴定报告一份

服务周期
  • 样品确认后30-180个工作日

仪器平台
  • Thermo Scientific LTQ Orbitrap


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